Kisspeptīnsir mazas molekulas peptīds, kas sastāv no 54 aminoskābju atlikumiem ar molekulmasu aptuveni 6000 daltonu. Tā aminoskābju secība ir ļoti konservēta zīdītājiem, kas nozīmē, ka tai ir līdzīgas struktūras dažādās sugās. Cilvēkiem Kisspeptin aminoskābju secība ir H-Phe Gly Gly Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Al Glu Leu Ser Eu Ser Arg Al Glu Eu Ser Arg. Šis gēns, ko kodē Kiss1 gēns, vispirms tiek transkribēts Kiss1 proteīna prekursorā, kas tiek pakļauts virknei apstrādes un savienošanas, lai galu galā izveidotu nobriedušu kisspeptīnu. Kisspeptīna noārdīšanos galvenokārt veic peptidāzes, kas to sadala mazākos fragmentos vai atsevišķās aminoskābēs. Spēlē izšķirošu lomu reproduktīvajā sistēmā. To uzskata par svarīgu gonadotropīnu atbrīvojošo hormonu (GnRH) atbrīvojošo faktoru, kas var stimulēt gonadotropīnu izdalīšanos, tādējādi veicinot dzimumšūnu nobriešanu un ovulāciju. Turklāt Kisspeptīns ir iesaistīts arī citu fizioloģisko procesu, piemēram, emociju, atmiņas un kognitīvo funkciju, regulēšanā.
Kisspeptīna peptīds, zināms arī kā Kiss1 peptīds vai RFRP-1 peptīds, ir cilvēka organismā atrodams neiropeptīds. Kisspeptīna sintezēšanai laboratorijā parasti izmanto šādas sintēzes metodes:
Ķīmiskā sintēze:
Ķīmiskā sintēze ir visbiežāk izmantotā kisspeptīna sintezēšanas metode laboratorijā. Šī metode ietver vairākas ķīmiskas reakcijas, piemēram, kondensāciju, aizsardzības atdalīšanu un atsāļošanu. To vidū galvenais solis ir peptīdu saišu veidošana starp aminoskābēm, parasti izmantojot klasiskos savienojošos līdzekļus, piemēram, EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) - karbodiimīds) vai BOP ( benzotriazol-1-il-oksi-tris(dimetilamino)fosfonija heksafluorfosfāts). Ķīmiskās sintēzes priekšrocība ir tā, ka ar to var iegūt augstas tīrības pakāpes kisspeptīnu, taču šīs metodes trūkums ir tāds, ka tai ir nepieciešami apgrūtinoši eksperimentālie soļi un stingri laboratorijas apstākļi, kamēr raža ir zema.
Konkrēti reakcijas soļi ir šādi:
1. Sagatavojiet izejas materiālus. Tas ietver nepieciešamās aminoskābes, aktivatorus (piemēram, EDC vai BOP), aizsardzības reaģentus (piemēram, trifluoretiķskābi vai bromūdeņražskābi), kā arī citus nepieciešamos reaģentus un buferšķīdumus.
2. Bezūdens un bez skābekļa apstākļos izšķīdiniet vajadzīgās aminoskābes atbilstošos šķīdinātājos, piemēram, dimetilformamīdā (DMF) vai N, N-dimetilacetamīdā (DMA).
3. Pievienojiet nepieciešamo aktivatoru (piemēram, EDC vai BOP) un maisiet istabas temperatūrā noteiktu laiku, lai izveidotu peptīdu saites.
4. Izveidotajām peptīdu saitēm pievienojiet aizsargreaģentus (piemēram, trifluoretiķskābi vai bromūdeņražskābi), lai noņemtu aminoaizsardzības grupas.
5. Pievienojiet vajadzīgās aizsarggrupas (piemēram, Boc vai Fmoc), lai aizsargātu jaunizveidotās aminogrupas.
6. Atkārtojiet iepriekš minētās darbības, līdz visas nepieciešamās aminoskābes ir savienotas.
7. Pievienojiet peptīdu ķēdei nepieciešamās sānu ķēdes modifikācijas un/vai marķierus.
8. Visbeidzot, tika veikta aizsardzības reakcija, lai noņemtu visas aizsarggrupas un iegūtu attīrītu kisspeptīnu.
Iepriekš minētā ir pamata ķīmiskās sintēzes metode, un konkrētās darbības var atšķirties atkarībā no konkrētās Kisspeptin secības un nepieciešamajām modifikācijām. Visa sintēzes procesa laikā ir stingri jākontrolē eksperimenta apstākļi, tostarp šķīdinātājs, temperatūra, pH, laiks un spiediens, lai nodrošinātu vienmērīgu reakcijas norisi un produkta augstu tīrību. Tajā pašā laikā ir jāpievērš uzmanība ķīmisko reakciju drošībai un jāizvairās no bīstamu reaģentu un darbību izmantošanas.
Gēnu inženierijas sintēze:
Gēnu inženierijas sintēze ir efektīva, ātra un ekonomiska kisspeptīna sintēzes metode. Šī metode izmanto gēnu inženierijas tehnoloģiju, lai ekspresētu kisspeptīna prekursoru proteīnu mikroorganismos, piemēram, Escherichia coli vai raugā, un pēc tam tiek veikta pēcapstrāde, lai iegūtu nobriedušu kisspeptīnu.
Tālāk ir norādīts vienkāršots process.
1. Gēnu klonēšana. Pirmkārt, ir jāiegūst kisspeptīna gēnu secība. To var iegūt no bioloģiskajiem audiem, izmantojot RT PCR, genoma sekvencēšanu vai citas gēnu klonēšanas metodes.
2. Vektora atlase: pēc tam jums ir jāizvēlas vektors, lai ievietotu Kisspeptin gēnu secību. Parasti tā ir nekaitīga baktēriju plazmīda vai vīrusu vektors. Vektors ir paredzēts Kisspeptin gēnu ievietošanai un ievadīšanai šūnā.
3. Gēnu transformācija: ievietojiet Kisspeptin gēnu vektorā un pēc tam pārnesiet šo kompleksu (gēns+vektors) inženierijas baktērijās, piemēram, Escherichia coli vai raugā.
4. Ekspresija: inženierijas baktērijās Kisspeptin gēns tiek "lasīts" un vada proteīnu sintēzi. Šie proteīni parasti tiek pievienoti īpašām ķīmiskajām etiķetēm turpmākajiem attīrīšanas procesiem.
5. Pēcapstrāde: šos kisspeptīna prekursoru proteīnus, ko ražo inženierijas baktērijas, var savākt un attīrīt, izmantojot tādus soļus kā šūnu fragmentācija, centrifugēšana un dialīze.
Šīs metodes priekšrocība ir tā, ka tā īsā laika periodā var ražot lielu daudzumu Kisspeptin, un izmaksas ir salīdzinoši zemas. Turklāt, pateicoties mikroorganismu izmantošanai, šai ražošanas metodei ir minimāla ietekme uz vidi. Tomēr šīs metodes trūkums ir tāds, ka tai ir nepieciešamas manipulācijas ar mikroorganismiem un tāpēc ir nepieciešamas noteiktas laboratorijas iekārtas un prasmes.
Bioenzīmu hidrolīze:
Bioenzīmu hidrolīze ir Kisspeptīna sintezēšanas metode, izmantojot enzīmu katalīzi. Šī metode izmanto specifiskus bioloģiskos enzīmus, lai Kisspeptin prekursoru proteīnus pārvērstu par nobriedušu kisspeptīnu.
Pamata soļi kisspeptīna sintezēšanai, izmantojot bioloģisko fermentatīvo hidrolīzi:
1. Gēnu klonēšana un vektora atlase. Pirmkārt, joprojām ir jāiegūst Kisspeptin gēnu secība un pēc tam jāizvēlas vektors, lai to ievietotu.
2. Ekspresija: ievietojiet Kisspeptin gēnu vektorā un pēc tam pārnesiet šo kompleksu (gēns+vektors) inženierijas baktērijās.
3. Olbaltumvielu sintēze: Inženierbaktērijās Kisspeptin gēns tiek "lasīts" un virza proteīnu sintēzi. Šīs olbaltumvielas parasti tiek pievienotas īpašām ķīmiskajām etiķetēm.
4. Bioenzimātiskā hidrolīze: specifisku proteāžu, piemēram, subtilizīna vai tripsīna, izmantošana, lai pārveidotu prekursoru proteīnus par nobriedušu kisspeptīnu. Bioloģiskiem fermentiem ir augsta specifika un katalītiskā efektivitāte, tāpēc šo reakcijas posmu var pabeigt ātri un efektīvi.
5. Pēcapstrāde. Veicot virkni darbību, piemēram, šūnu sadrumstalotību, centrifugēšanu, dialīzi utt., Kisspeptīns beidzot tiek savākts un attīrīts.
Šīs metodes priekšrocība ir tā, ka tā var īsā laikā pabeigt Kisspeptin sintēzi. Ne tikai ātrs sintēzes ātrums, bet arī bioloģisko enzīmu katalītiskā efektivitāte ir ārkārtīgi augsta, kas var ievērojami uzlabot mērķa proteīnu iznākumu. Tikmēr bioloģiskajiem fermentiem, ko izmanto fermentatīvā hidrolīzē, bieži ir augsta specifika un tie var precīzi un efektīvi darboties sarežģītās bioloģiskās molekulās. Tāpēc šī metode ir videi draudzīga un maz ietekmē mērķa proteīna struktūru un funkcijas. Tomēr šai metodei ir arī noteikti ierobežojumi, piemēram, grūtības iegūt un sagatavot bioloģiskos fermentus, augstas izmaksas un nepieciešamība precīzi kontrolēt reakcijas apstākļus.
Šūnu kultūra:
Šūnu kultūra ir Kisspeptīna sintezēšanas metode laboratorijā. Šī metode ietver šūnu līnijas kultivēšanu, kas satur Kisspeptin gēna secību, un pēc tam izdalītā kisspeptīna savākšanu no barotnes. Konkrēti, Kisspeptin gēnu secība vispirms tiek ievietota šūnu līnijā, kam seko šūnu kultūra un stāvokļa optimizācija. Visbeidzot, kisspeptīnu savāc no barotnes. Šūnu kultūras priekšrocība ir tā, ka tā var ražot lielu daudzumu kisspeptīna, un šīs metodes darbība ir salīdzinoši vienkārša.
Rezumējot, Kisspeptīna sintezēšanai laboratorijā ir dažādas metodes, un katrai metodei ir savas priekšrocības un trūkumi. Sintēzei var izvēlēties piemērotas metodes atbilstoši faktiskajām vajadzībām. Tostarp ķīmiskā sintēze un gēnu inženierijas sintēze ir visbiežāk izmantotās metodes, savukārt fermentatīvā hidrolīze un šūnu kultūra ir citas iespējamas iespējas.