GLP-1(saite:Skatīt šeit: https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/GLP-1-peptide-Cas-87805-34-3.html) ir polipeptīdu hormons, kas sastāv no 30 aminoskābēm. Līdz ar padziļinātu GLP-1 izpēti ir izstrādātas arvien vairāk sintētisko metožu. Šajā rakstā tiks sistemātiski iepazīstināts ar pašlaik zināmajām GLP sintēzes metodēm-1.
1. metode, cietās fāzes sintēze:
Cietās fāzes sintēze ir plaši izmantota peptīdu un olbaltumvielu sintēzes metode, un to parasti izmanto arī GLP sintēzei-1. Cietās fāzes sintēzē kodola struktūra veidojas, pirmo aminoskābi saistot ar sveķiem. Pēc tam secīgi pievieno nākamo aminoskābi un ķīmiski reaģē ar atbilstošu kondensācijas līdzekli. Visbeidzot, mērķa produktu var iegūt, atdalot polipeptīdu no sveķiem.
Cietās fāzes sintēzes nozīme ir tāda, ka tā nodrošina peptīdu sintēzes automatizāciju un liela mēroga ražošanu. Pašreizējās galvenās cietfāzes sintēzes metodes ietver Fmoc un Boc. Tostarp Fmoc metode peptīda aizsardzībai izmanto N-Fmoc aizsarggrupu, savukārt Boc metode izmanto terc-butiloksikarbonilgrupu, lai aizsargātu karboksilgrupu.
Otrā metode, šķidrās fāzes sintēze:
Šķidrās fāzes sintēze ir tradicionāla peptīdu sintēzes metode, kurā reaģenti reakcijai tiek ievietoti šķidrajā fāzē. Šķidrās fāzes sintēzes priekšrocība ir tāda, ka reakcijas apstākļi ir viegli un piemēroti jutīgu ķīmisko struktūru modificēšanai. Tomēr pārāk daudz reaģentu dēļ attīrīšanas process ir salīdzinoši apgrūtinošs. Ķīmiskās reakcijas šķidrās fāzes sintēzē ietver:
1. Kondensācijas reakcija:
Kondensācijas reakcija ir viena no pamata reakcijām peptīdu sintēzē, tas ir, karboksilgrupa, ko ierosina kondensācijas aģenti, piemēram, DCC un HOBt, tiek savienota ar aminoskābes aminogrupu acilēšanas reakcijas ceļā. Reakcijas apstākļi ir viegli un raža ir augsta.
2. Eliminācijas reakcijas:
Eliminācijas reakcija ir reducēt metionīnu par ditiolu ar NaBH4 un citiem reducējošiem līdzekļiem, padarot to neaktīvu. Reakcija jāveic pamata apstākļos.
3. Aizsarggrupu noņemšana:
Tā kā peptīdu ķēdē ir dažādas aminoskābju funkcijas, aizsardzībai tiks izmantotas dažādas aizsarggrupas. Kad sintēze ir pabeigta, aizsarggrupa ir jānoņem. Fmoc metodei parasti izmanto piperidīnu, lai noņemtu Fmoc; savukārt Boc metodei TFA izmanto Boc noņemšanai.
Trešā metode, ķīmiskā sintēze:
GLP-1 ir polipeptīdu hormons ar svarīgām bioloģiskām aktivitātēm. Tās sintēzi var realizēt ar dažādām metodēm, starp kurām ķīmiskā sintēze ir viena no visbiežāk izmantotajām metodēm. Ķīmiskās sintēzes priekšrocība ir tā, ka tā var ražot ļoti tīrus mērķa produktus, kas ir piemēroti liela mēroga ražošanai. Ķīmiskās sintēzes metode un detalizētas GLP-1 darbības tiks iepazīstinātas tālāk.
1. Sintētiskā ceļa un aizsarggrupu izvēle:
GLP{0}} molekula sastāv no 36 aminoskābēm, tostarp 21 L tipa un 15 D tipa aminoskābēm. Pirms sintēzes veikšanas ir nepieciešams izvēlēties piemērotu sintēzes ceļu un izvēlēties atbilstošo aizsarggrupu atbilstoši sintēzes apstākļiem. Fmoc cietās fāzes sintēzi parasti izmanto automatizētai liela mēroga sintēzei. Šajā metodē kā aizsarggrupa tiek izmantota N-9-fluorimidokarboksilgrupa (N-Fmoc), kā arī ir jāizvēlas atbilstoša sekundārā aizsarggrupa (piemēram, terc-butilgrupa vai metilgrupa), lai nodrošinātu konkrētu vietu aizsardzību. Katru reizi, kad tiek pievienota jauna aminoskābe, vispirms ir jānoņem Fmoc aizsarggrupa un pēc tam jāpievieno nākamās aminoskābes aizsargātā savienojošā viela.
2. Galvenās aminoskābju secības sintēze:
GLP{0}} pamatsekvence sastāv no 21 aminoskābes, tostarp galvenā serīna un četrām prolilglutamīnskābes dipeptīdu sekvencēm. Cietās fāzes sintēzē kodolsekvences sintēzi var iedalīt šādos posmos:
2.1. Pievienojiet etiķskābes karbamātu (Fmoc-NH-CH2CO2Et) un 2-Cl-Trt-Cl cietās fāzes sintētiskajiem sveķiem un veiciet kondensācijas reakciju ar DIC/NMM savienojošo līdzekli.
2.2. Noņemiet Fmoc aizsarggrupu, atdalot grupas reakciju.
2.3. Pievienojiet nākamo aminoskābi, pēc kārtas atkārtojiet 1. un 2. darbību, līdz tiek sintezēta galvenā secība.
2.4. Pentapeptīdu struktūru veidošanās uz cietās fāzes sveķiem. Pievienojiet acetalizācijas reaģentu cietās fāzes sveķiem, reaģējiet ar N-gala atpazīšanas līdzekli (piemēram, HBTU), pievienojiet serīna sānu ķēdes aizsarggrupu kā palīgreducētāju un pēc tam noņemiet Fmoc aizsardzības grupu.
2.5. Bacillus subtilis transferāzes (ProTide) katalīzes rezultātā pentapeptīda struktūrā notiek apmaiņas reakcija ar serīna jodacetāta prekursoru.
3. Atlikušo aminoskābju secības sintēze:
Pēc kodolsekvences sintēzes pabeigšanas jāturpina pievienot atlikušās aminoskābes, ieskaitot L un D tipa aminoskābes. Šo aminoskābju pievienošana jāsāk no galvenās secības, jāpievieno nākamā aminoskābe pēc kārtas un jāizmanto atbilstošs kondensācijas līdzeklis, lai veiktu ķīmiskās reakcijas, līdz tiek sintezēta pilnīga GLP-1 polipeptīda molekula. Šī procesa laikā ir nepieciešams arī izvēlēties atbilstošu aizsarggrupu pēc vajadzības un secīgi veikt reakcijas, aizsarggrupas noņemšanas un aminoskābju pievienošanas posmus.
4. Apstrāde ar nātrija hidroksīdu:
Pēc visu aminoskābju pievienošanas uz cietās fāzes sveķiem veidojas nepilnīgi sintezēta peptīdu ķēde, un tā ir jāapstrādā, lai izveidotu pilnībā izveidotu peptīda molekulu. Pirmkārt, neveidotais peptīds jāhidrolizē ar nātrija hidroksīdu, lai C-gala karboksilgrupa, kas sākotnēji pievienota sveķiem, tiktu atdalīta no sveķiem un aizsarggrupa tiktu atdalīta ūdenī. Pēc hidrolīzes reakcijas iegūst mērķa produktu.
5. Nokrišņi un mazgāšana:
Pēc apstrādes hidrolizēto šķīdumu apstrādā ar skābi, lai izgulsnētu mērķa produktu. Pēc tam granula tika atkārtoti suspendēta ūdenī, kam sekoja intensīva mazgāšana, lai noņemtu piemaisījumus.
6. Attīrīšana:
Pēdējais posms ir vēlamā produkta attīrīšana, parasti izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Šī procesa laikā produkta tīrību var noteikt, nosakot šķīduma maksimumu masu spektrā. Īsāk sakot, GLP{0}} ķīmiskajai sintēzei ir nepieciešami vairāki sarežģītu reakciju posmi un stingri attīrīšanas procesi, lai beidzot iegūtu aktīvo mērķa produktu.
Ceturtā metode, biosintēze:
GLP-1 ir svarīgs polipeptīdu hormons ar dažādu fizioloģisku iedarbību, tostarp veicina insulīna sekrēciju, nomāc ēstgribu, samazina ķermeņa masu un uztur insulīna jutību utt. GLP-1 biosintēzes metodi galvenokārt sintezē L šūnas. aizkuņģa dziedzerī, un tā sintēzes ātrumu regulē ar uzturu. Detalizēti soļi tiek ieviesti šādi:
1. Sagatavošanas darbi pirms sintēzes:
Pirms GLP{0}} biosintēzes ir jāveic daži sagatavošanās darbi, tostarp jānosaka izmantotais šūnu tips, jāiestata kultivēšanas apstākļi un jāizvēlas atbilstošs katalītiskais enzīms. L šūnas ir galvenais GLP-1 sintēzes avots, jo tās satur divu hormonu, GIP (glikagonam līdzīgā peptīda 1) un GLP-1 prekursorus. L šūnas var izolēt no trušu vai peļu zarnu epitēlija. Pirms biosintēzes šūnas ir jākultivē līdz pietiekamam skaitam, un jānodrošina pietiekami daudz barības vielu un piemēroti audzēšanas apstākļi. Turklāt ir nepieciešams izvēlēties atbilstošu katalītisko enzīmu, lai veicinātu reakciju.
2. Prekursoru sintēze un apstrāde:
GLP{0}} biosintēze galvenokārt notiek L šūnās, un tās prekursors sastāv no diviem hormoniem – GIP un GLP-1. Pēc iekļūšanas endokrīnās šūnās GIP un GLP-1 tiek apstrādāti ar proteolītiskajiem enzīmiem un sadalīti atsevišķos peptīdos. Šajā procesā ir iesaistīta virkne enzīmu un kofaktoru, tostarp prekursoru polipeptīda acidāze (PC2), izomerāze un vēlīnās adhēzijas faktori.
3. Savstarpēja konversija starp polipeptīdu segmentiem:
Pēc apstrādes GIP un GLP{0}} peptīdi tiek rekombinēti, veidojot GLP-1 polipeptīdu. Šim procesam ir jāizmanto glikagonam līdzīgs peptīds 1 (GLP-1) kā veidne, pie kuras tiek apvienoti citi atsevišķi peptīdi, veidojot jaunus saliktus polipeptīdus. Šim procesam ir nepieciešami arī daži specifiski enzīmi un faktori, tostarp Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) un Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1 sekrēcija:
Pēc GLP-1 sintezēšanas un apstrādes tas tiek uzglabāts endokrīno šūnu citoplazmā un iekšējās pūslīšos. Uztura stimulētas endokrīnās šūnas atbrīvo GLP-1 un caur mikrovaskulāriem iekļūst asinsritē. Šis process tiek regulēts un kontrolēts, izmantojot virkni signālu pārraides ceļu, tostarp cAMP-Ca2 plusun tā tālāk.
Īsāk sakot, GLP{0}} biosintēze ietver vairāku saišu un faktoru kopīgu darbību. Biosintēzes un ķīmiskās sintēzes kombinācija var nodrošināt labāku pamatu un atbalstu GLP izpētei un ražošanai-1.
Piektā metode, fermentatīvā sintēze:
Fermentatīvā sintēze ir peptīdu ķēžu sintēze, izmantojot bioloģisko enzīmu katalīzi. Salīdzinot ar tradicionālajām šķidrās fāzes sintēzes metodēm, fermentatīvo sintēzi var veikt istabas temperatūrā, un var izvēlēties plašu izejvielu klāstu. Lai katalizētu sintēzi, parasti tiek izmantoti enzīmi, piemēram, teta-šķidrā sintāze, AEP, ACE utt.
Noslēgumā jāsaka, ka iepriekš minētās metodes ir iespējamas GLP{1}} sintēzes metodes. Dažādiem eksperimentālajiem apstākļiem un farmācijas ražošanas vidēm ir piemērotas dažādas metodes.