Aprotinīns CAS 9087-70-1

Aprotinīns78R2S7, molekulārā formula C284H432N84O, CAS 9087-70-1, tas ir proteāzes inhibitors, kas var inhibēt tripsīnu un himotripsīnu, novērst citu aktīvo proteasomu aktivāciju aizkuņģa dziedzerī un tripsinogēna pašaktivizēšanos. Klīniski lieto akūta pankreatīta, fibrinolīzes izraisītas asiņošanas un diseminētas intravaskulāras koagulācijas profilaksei un ārstēšanai. To var izmantot arī pretšoka ārstēšanai. Proteāzes inhibitori ir vielas, kas var saistīties ar fermentiem un samazināt substrāta noārdīšanās ātrumu. Proteāzes inhibitori ar proteīna īpašībām ir plaši izplatīti, un no sojas pupiņām ir izolēti divu veidu proteāzes inhibitori ar olbaltumvielu īpašībām: Kuniz tripsīna inhibitors un Baumann Bellck inhibitors. Pirmā molekulmasa ir 20–25 ku, bet otrā molekulmasa ir 8 ku.

Rekombinantsaprotinīns(RTI16) var inhibēt kinināzi un tripsīnu, un tas ir dabisks ne-specifisks serīna proteāzes inhibitors. Tas ir vienas ķēdes bāzes proteīns, kas sastāv no 58 aminoskābju atlikumiem, un ķēdē ir šķērssaites -disulfīda saites. Ilgu laiku aprotins ir lietots akūta pankreatīta ārstēšanai. Pēc 1990. gadiem rekombinanto aprotinnu sāka lietot kardiotorakālajā ķirurģijā, lai aizsargātu trombocītus, samazinātu asiņošanu un eksudāciju, kā arī klīniskai ārstēšanai pacientiem ar asinsreces traucējumiem. Tāpēc aprotinna tirgus apjoms ir strauji paplašinājies un kļuvis par vienu no svarīgākajām bioķīmiskajām zālēm.

Sintēze

 

Pašlaik komerciāli pieejamie rekombinantie aprotīna preparāti galvenokārt ir ekstrakti no tādiem orgāniem kā liellopu plaušas, kam ir sarežģīti procesi un augstas izmaksas. Tāpēc ir ļoti svarīgi izpētīt rekombinantā aprotīna ražošanu, izmantojot gēnu inženierijas metodes.

Izmantojot sekrēcijas ekspresijas sistēmu, aprotinīna ražošana parasti ir zema, un iegūtā produkta aktivitāte ir arī zema. Paredzams, ka, izmantojot saplūšanas ekspresiju, tas ievērojami palielinās rekombinantā aprotīna ekspresijas līmeni.

 

Šim nolūkam tika izveidota rekombinantā aprotīna ekspresijas plazmīda pGrxA BPTI, un starp saplūšanas partneri un rekombinanto aprotīnu tika izveidota FXa atpazīšanas vieta. Pēc ekspresijas iekļaušanas ķermeņa formā saplūšanas partneris tika attīrīts un atkārtoti salocīts ar gēla filtrēšanu. FXa izgrieza saplūšanas partneri, lai iegūtu proteīnu ar tādu pašu aktivitāti kā dabiskajam produktam. Optimizējot ekspresijas apstākļus, raža tika ievērojami uzlabota salīdzinājumā ar iepriekšējām ekspresijas sistēmām.

Inženierbaktēriju ekspresijas optimizācija:

 

Inokulējiet glicerīna caurules baktērijas uz LB/AMP agara plāksnēm, kultivējiet 37 grādu temperatūrā 20 stundas, nokasiet kolonijas un inokulējiet tās 5 ml LB/AMP šķidrās barotnes 37 grādu temperatūrā, 200 apgr./min un kultivējiet nakti. Inokulējiet 5% inokulāta 100 ml kukurūzas vircas barotnes, kultivējiet 37 grādu temperatūrā un 220 apgr./min kratītājā, inducējiet 7 stundas un pēc tam centrifugējiet (8000 apgr./min, 5 min, 4 grādi), lai savāktu baktēriju šūnas. Nosveriet baktēriju šūnu slapjo svaru un nosakiet to ekspresiju ar 15% SDS-PAGE.

Fermentācijas tvertnes audzēšana

 

Fermentācijas tvertnes audzēšana:

Izmantojot vācu Biostat 30 l fermentācijas tvertni, 37 grādu temperatūrā ar izšķīdušā skābekļa kontroli uz 20%, pH 7,0. Izmantojot fermentācijas tvertni sapludinātā proteīna ekspresēšanai, no 16 l fermentācijas buljona tika iegūti 260 g mitru baktēriju šūnu, aptuveni 16 g/l; Izteiksmes līmenis ir aptuveni 45%,

Sienu laušana un baktēriju šūnu iekļaušanas ķermeņa iegūšana:

 

Kad kultivēšana ir pabeigta, savāciet baktēriju šūnas, pievienojiet 1 g baktēriju šūnu 10 ml šķīduma A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), kārtīgi suspendējiet, apstrādājiet šūnas ar ultraskaņu ledus vannā, strādājiet 30 sekundes, intervāls 10 W, jauda 40 s. Pārnesiet šķidrumu centrifūgas mēģenē, centrifugējiet ar 4 grādiem un 8000 apgr./min 15 minūtes, un nogulsnes ir neapstrādāts ieslēguma ķermenis.

Iekļaušanas ķermeņa šķīdināšanas šķīduma pagatavošana:

 

Mazgājiet neapstrādātu ieslēguma ķermeni ar šķīdumu B (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) divas reizes, katru reizi 0,5 stundas, centrifugējiet, lai noņemtu supernatantu, un iegūstiet salīdzinoši tīrus ieslēguma ķermeņus. Pievienojiet 1 g ieslēguma ķermeņu 5 ml šķīduma C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L urīnviela, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), inkubējiet nakti 4 grādu temperatūrā, denaturējiet un izšķīdiniet, centrifugējiet ar ātrumu 12 000 apgr./min un savāc šķīduma inkluzīvu 15 minūtes. Iegūstiet rekombinanto aprotīnu.

Farmakoloģiskā iedarbība:

 

 

Aprotinīnsinhibē cilvēka tripsīnu, fibrinolītisko enzīmu, plazmu un audu angiotenzīnu, izmantojot atgriezeniskus enzīmu inhibitoru kompleksus, kas veidojas noteiktā ķīmiskā proporcijā. Proteāzēm ar serīna aktivitāti ir liela nozīme vazopresīna kininogēna kinīna sistēmā, komplementa sistēmā un koagulācijas sistēmā, kur plazmīnam un plazmas vazopresīnam ir būtiska loma.

 

Aprotins iedarbojas uz inhibējošu iedarbību, veidojot aprotīna proteāzes kompleksu caur serīna aktīvo daļu uz fermenta. Tomēr, ja to apvieno ar dažādām proteāzēm, tam ir atšķirīgas disociācijas konstantes. Saistīšanās ar tripsīnu ir visspēcīgākā (Ki=0.06nmoN), kas ir viena no zemākajām konstantēm, par kurām ziņots proteīnu -proteīnu mijiedarbībā (Laydunski et al. 1974). Saistīšanās ar cilvēka fibrinolītisko enzīmu nav ļoti spēcīga. Sakarā ar fermentu inhibitoru kompleksa augsto K vērtību (Ki=1 nmoN), tas var būt atgriezenisks (Wimann, 1980), un komplekss, kas saistās ar cilvēka plazmas angiotenzīnu, ir diezgan vājš (Ki=30 nmol/l), taču joprojām ir aprotīna terapeitiskajā diapazonā (Nakahara, 1983).

 

Aprotinns saistās ne tikai ar brīvām enzīmu molekulām, bet arī fermentiem, kas jau ir saistījušies ar trešo komponentu (ja fermenta aktīvajam centram joprojām ir saistīšanās spēja). Tāpēc aprotins inhibē brīvos fibrinolītiskos enzīmus un var arī inhibēt starpposma fibrinolizīna ķēdes kināzes kompleksu, kas veidojas trombolītiskās terapijas laikā ar ķēdes kināzi (Wimann, 1980).
Aprotīna antifibrinolītiskā iedarbība balstās uz plazmīna inhibīciju, ko aktivizē proteīnu hidrolīze. Atšķirībā no sintētiskiem antifibrinolītiskiem šķīdinātājiem, jo ​​tiešā veidā inhibē pārmērīgi aktivētu plazmīnu, aprotīns ne tikai aizsargā tiešo substrātu (fibrīnu) no plazmīna noārdīšanās, bet arī aizsargā fibrinogēnu, V un VIII faktorus plazmā un alfa 2-globulīnu serumā.

 

Endotoksīna izraisīta šoka un hipovolēmiskā šoka eksperimentos Trasylol var ievērojami kavēt kininogēna aktivāciju. (Massion et a1, 1972).
Trasilols var novērst vai aizkavēt plaušu intersticiālas tūskas (šoka plaušu) attīstību. Tā inhibējošā iedarbība ir atkarīga no devas un laika (Lorthioir et al., 1973).
Šoka laikā išēmisks aizkuņģa dziedzeris var ražot ļoti toksisku peptīdu vielu, proti, miokarda inhibējošo faktoru (MDF). Šis faktors ir cieši saistīts ar nāvi no šoka.

 

MDF var noteikt peļu, suņu, pērtiķu un cilvēku plazmā ar hemorāģisko, septisko, kardiogēno šoku un apdeguma šoku. MDF var izraisīt miokarda kontraktilitātes samazināšanos visos asiņošanas gadījumos, un tajā pašā laikā tas izraisa viscerālās rezistences asinsvadu kontrakciju, izraisot lokālu išēmiju un vairāk MDF veidošanos. Turklāt retikuloendoteliālās sistēmas toksisko bojājumu dēļ tās izvadīšana asinsritē tiek aizkavēta. Trasilols var ievērojami novērst MDF ražošanu (Lefer 1984).

Aprotinīns, kā mazas molekulas savienojums, kas iztur fibrinolīzi, uzrāda nozīmīgas un specifiskas fermentus inhibējošas īpašības. Tas ne tikai efektīvi inhibē tripsīna aktivitāti, bet arī plaši iedarbojas uz citiem radniecīgiem proteolītiskajiem enzīmiem, tādējādi spēlējot nozīmīgu lomu šūnu bioloģijas eksperimentos. Īpaši šūnu un audu līzes un homogenizācijas laikā Aprotinn var kalpot kā efektīvs proteāzes inhibitors, efektīvi novēršot nejaušu mērķa proteīnu sadalīšanos, kas ir ļoti svarīgi, lai saglabātu parauga integritāti un precizitāti.

Aprotinn inhibējošā iedarbība uzrāda skaidru atkarību no devas, tas ir, palielinoties tā koncentrācijai, attiecīgi palielinās arī inhibējošā iedarbība uz fibrinolītisko aktivitāti. Šī funkcija ļauj pētniekiem precīzāk kontrolēt eksperimentālos apstākļus, lai iegūtu ticamākus un reproducējamākus eksperimentālos rezultātus. Tikmēr Aprotinn var arī pagarināt asins recēšanas laiku, vēl vairāk apstiprinot tā svarīgo lomu koagulācijas mehānismā. In vitro eksperimenti ir parādījuši, ka Aprotinn ir efektīvs endogēnā koagulācijas ceļa inhibitors, kas var traucēt un regulēt galvenos koagulācijas procesa procesus.

Aprotini ir pierādījis arī savu unikālo farmakoloģisko iedarbību. Tas var ievērojami kavēt asins recekļu šķīšanas procesu in vitro, pagarināt astes apgriešanas asiņošanas laiku žurkām un pagarināt koagulācijas laiku cilvēka plazmā. Šie atklājumi liecina, ka Aprotinn var izraisīt pretasiņošanu un antitrombotisku iedarbību. Lai vēl vairāk apstiprinātu tā in vivo efektu, pētnieki veica eksperimentus ar žurku arteriovenozo īssavienojuma modeli. Rezultāti parādīja, ka Aprotnin var ievērojami samazināt asins recekļu svaru, vēl vairāk atbalstot tā kā prettrombotiskas zāles potenciālu.

Rezumējot, Aprotnīns kā mazas molekulas savienojums, kas inhibē fibrinolīzi, ir pierādījis nozīmīgas enzīmus inhibējošas īpašības un farmakoloģisko iedarbību gan in vitro, gan in vivo. Tās pielietojums šūnu bioloģijas eksperimentos sniedz pētniekiem jaudīgus rīkus, savukārt in vivo pētījumos iegūtie atklājumi sniedz svarīgus norādījumus un pamatu tās attīstībai kā pretasiņošanas un prettrombotiskas zāles. Nākotnē, veicot turpmākus pētījumus par Aprotnin darbības mehānismu un klīniskajiem pētījumiem, mēs redzēsim tā plašāku pielietojumu medicīnas jomā.

Populāri tagi: aprotinin cas 9087-70-1, piegādātāji, ražotāji, rūpnīca, vairumtirdzniecība, pirkt, cena, lielapjoma, pārdošana